Biorremediación y fitorremediación de suelo impactado por 85,000 ppm de aceite residual automotriz

El suelo contaminado por 85,000 ppm de aceite residual automotriz (ARA), es una mezcla de hidrocarburos alifáticos, aromáticos, policíclicos y trazas de elementos metálicos, derivado del uso de automotores de combustión interna y maquinaria industrial. En México un suelo con concentración de ARA de este nivel es un problema ambiental, pues está clasificado como un residuo peligroso según la Ley General de Equilibrio Ecológico y Protección Ambiental (LGEEPA, 2014); especialmente en suelo donde la regulación mexicana al respecto conocida como NOM-138-SEMARNAT/SSA1-2003 (NOM-138): establece como límite máximo permisible 4,400 ppm un valor total; dividido en la fracción ligera de 200 ppm; en la mediana de 1,200 ppm y de la pesada de 3,000 ppm. En el suelo 85,000 ppm causa un impacto negativo, en principio por la insolubilidad de la diversidad simple y compleja de la mezcla de hidrocarburos que, impide el intercambio gaseoso con la atmósfera, inhibe la mineralización de materia orgánica que provoca la pérdida de fertilidad y en consecuencia reduce la producción vegetal (Juárez-Cisneros y Sánchez-Yáñez, 2014, Burghal et al., 2015). En el suelo una alternativa ecológica de solución al problema de ésta relativa elevada concentración del ARA, es la bioestimulación (BIS), de forma secuencial, complementaria y acumulativa dado que ésta mezcla es diversa en términos de la complejidad química, lo que hace necesario aplicar un estrategia integradora; en principio mediante un detergente que solubiliza la mayor parte de los hidrocarburos que lo componen; de una solución mineral que reequilibre la relación C (carbono): N (nitrógeno), provocada por el exceso de ARA en ese ambiente; así como de H₂O₂ (como una fuente disponible de O₂), que facilite su continua oxidación; que incluya un extracto fúngico crudo que contenga la enzima extracelular lacasa, que podría hidrolizar parcialmente la fracción aromática (Baltierra-Trejo et al., 2016), y permita su posterior mineralización. En suelo para integrar estas múltiples acciones de BIS, es indispensable ajustar la humedad al 80 % de la capacidad de campo, lo cual podría inducir a la microbiota autóctona heterótrofa aerobia, una oxidación eficaz del ARA y concluirla por fitorremediación (FITO), con una leguminosa tolerante a los hidrocarburos del tipo: Phaseolus vulgaris potenciada mediante Micromonospora echinospora y/o Streptomyces griseus; géneros de actinomicetos señalados en la literatura con capacidad de oxidar algunos de los aromáticos existentes en el ARA (Solans y Vobis, 2003; Riojas-González et al., 2010), y decrecer el ARA remanente a una concentración inferior a la máxima aceptada por la NOM-138. Con base a lo anterior, los objetivos de este trabajo fueron: i) BIS de suelo contaminado por 85,000 ppm de ARA, ii) FITO con P. vulgaris potenciado mediante M. echinospora y/o S. griseus para disminuir el ARA a un valor inferior al mayor permisible en la NOM-138.

Esta investigación se realizó en un invernadero bajo las siguientes condiciones microclimáticas promedio: temperatura de 23.2 °C, luminosidad de 450 µmol·m^-2·s^-1 y humedad relativa del 67%.

El suelo se tamizó con una malla del No. 20 y contaminó con 85,000 ppm de ARA proveniente de un taller mecánico automotriz de la ciudad de Morelia, Mich, México, para ello el ARA se emulsificó en agua con el detergente la “Corona®” al 0.5 % (p/v); luego un 1.0 Kg de este suelo con, se colocó en la parte superior de la jarra de Leonard mostrada en la figura 1, mientras que el recipiente soporte, se llenó con la solución mineral y/o agua en función del diseño experimental planteado (García-González et al., 2005). El ensayo se inició con la: i) BIS secuencial del suelo impactado por ARA, con el detergente la “Corona®” al 0.5 % (p/v), luego la BIS fue complementada mediante una solución mineral cuya composición química fue la siguiente (g/L): NH₄NO₃, 10; K₂HPO₄, 2.5; KH₂PO₄, 2.0; MgSO₄, 1.0; NaCl, 0.1; CaCl₂, 0.1; FeSO₄, trazas y 10.0 ml/L de solución de microelementos (g/L): H₃BO₃, 2.86; ZnSO₄. 7H₂O, 0.22; MgCl₂. 7H₂O, 1.81; ajustada a pH 6.8-7.0; después la BIS se complementó con la adición de H₂O₂ al 0.5%; y un extracto fúngico crudo (EXFUCU); que contenía la lacasa para la degradación parcial de la fracción aromática del ARA. Para ello se cultivó Penicillium chrysogenum en la lignina residual de paja de trigo (LIREPATO); obtenida de la siguiente manera: 100 g de paja de trigo seca, se molieron y tamizaron en una malla de 0.0841 mm; que luego se trató con CH₃-COOH (ácido acético) al 10%/30 min en proporción 1:2 (p/v), después la mezcla se neutralizó con NaOH al 10%; y se sometió a autoclave a 120°C/60 min, posteriormente se lavó con agua destilada a pH 7.0; y finalmente se secó a 70°C/24 h. Para la generación del EXFUCU se usaron 12.5 mL P. chrysogenum que se sembraron en un matraz de 500 mL con 250 mL de caldo LIREPATO cuya contenido fue (g/L): LIREPATO 10.0; peptona de caseína 5.0; extracto de levadura 1.3 ; K₂HPO₄ 0.17; KH₂PO₄ 2.61; MgSO₄ 1.5; NaCl 0.9 ; CuSO₄ 0.05; 2.5 mL del detergente la Corona® al 10% (p/v), y 1.0 mL/L de una solución de oligoelementos, ajustado a pH a 5.5 que esterilizó a 121°C/20min (Baltierra-Trejo et al., 2016). El matraz con P. chrysogenum se incubó a 30ºC/12 días, después de lo cual el medio de cultivo se filtró y centrifugó para el eliminar el hongo, y posteriormente se usaron 100 mL de EXFUCU/Kg de suelo impactado por el ARA, cada semana hasta iniciar la FITO (Saucedo-Martínez et al., 2016). En tanto que en el suelo la humedad se controló al 80 % de la capacidad de campo, esto favoreció la integración de la acciones de BIS que decrecieron el ARA remanente para la siguiente etapa; ii) FITO mediante P. vulgaris potenciado con M. echinospora y/o S. griseus; ambos actinomicetos (aislados de nódulos de Medicago sativa), se reprodujeron en agar avena (AA) con la siguiente composición (g/L): avena 30.0; MgSO₄.7H₂0 1.0; PO₄H₂K 1.5; Tecto al 10% 1.0; Agar 18.0; pH 6.8, se incubaron a 30°C/72 h. Para potenciar la leguminosa con los actinomicetos se realizó lo siguiente operación: por cada 20 semillas de P. vulgaris se inocularon con 1.0 mL de cada género de actinomiceto crecido en agar AA, a una concentración celular de ambos, que se ajustó a la solución patrón No.2 del nefelómetro de McFarlad, con un 1.0 mL del detergente al 10% se diluyó en 99.0 mL de NaCl 0.85%; para facilitar la completa homogenización y alcanzar una concentración celular de 1.5x108 UFC/g; de M. echinospora y S. griseus mezclados en una relación 1:1 (v/v) (García-González et al., 2005) y continuar con el diseño experimental mostrado en la tabla 1 de bloques al azar con: 3 controles: suelo sin ARA irrigado solo con agua o control absoluto (CA); el suelo impactado por ARA sin bioestimular, ni fitorremediar o control negativo (CN); el suelo sin contaminar por ARA alimentado con la solución mineral o control relativo (CR), y los 4 tratamientos para la fase de FITO a) suelo impactado por ARA bioestimulado y fitorremediado con P. vulgaris sin potenciar mediante M. echinospora y/o S. griseus, b) P. vulgaris potenciado con M. echinospora sembrado en suelo impactado por ARA c) P. vulgaris potenciado mediante S. griseus sembrado en suelo impactado por ARA d) P.vulgaris potenciado con M. echinospora y S. griesus sembrado en suelo impactado por ARA. Los valores numéricos de los experimentos se analizaron mediante ANOVA/Tukey HSD P<0.05% con el programa estadístico Statgraphics Centurión.

La BIS de suelo impactado por ARA se muestra en la tabla 2, con el detergente, una solución mineral, el H₂O₂ y el extracto fúngico crudo, con el 80% de la capacidad de campo durante 150 días. En ese suelo la concentración inicial de ARA fue de 85,000 ppm que decreció hasta 29,000 ppm, ambos valores numéricos fueron estadísticamente diferentes, comparados con los valores análogos en el suelo impactado por ARA sin BIS o CN, ahí la atenuación natural redujo el ARA desde 85,000 ppm hasta 59,500 ppm.

La fenología y biomasa de P. vulgaris potenciado mediante M. echinospora y S. griseus a nivel de plántula, durante la FITO de suelo contaminado por 29,000 ppm de ARA se muesta en la tabla 3, ahí P. vulgaris alcanzó una altura de planta (AP) de 15.32 cm y una longitud radical (LR) de 14.25 cm, estos valores numéricos no tuvieron diferencia estadística comparados con los 15.67cm de AP y 15.25 cm de LR de P. vulgaris alimentado con un solución mineral, sin potenciar con M. echinospora y S. griseus sembrado en suelo sin ARA. Pero si mostraron diferencia estadística comparados con los valores de 13.15 cm de AP y 7.60 cm de LR de P. vulgaris, sin potenciar con estos actinomicetos promotores de crecimiento vegetal, sembrado en suelo impactado por el ARA. En tanto que P. vulgaris en suelo sin ARA, se registró un peso fresco aéreo (PFA) de 1.96 g en P. vulgaris usado como CR, valor numérico sin diferencia estadística a los 1.86g de PFA en P. vulgaris potenciado con la mezcla de M. echinospora/S. griseus en suelo impactado por el ARA; ambos valores numéricos de PFA fueron estadísticamente diferentes a los 1.30g de PFA en sin potenciar con los actinomicetos, sembrado en suelo contaminado por ARA. Respecto al peso fresco radical (PFR) se registraron 1.18g en P. vulgaris potenciado mediante M. echinospora y S. griseus; cuyo valor numérico fue estadísticamente diferente a los 0.89g de PFR en P. vulgaris sin potenciar con estos actinomicetos, alimentado con una solución mineral sembrado en suelo sin impactar por el ARA o CR; respecto al peso seco aéreo (PSA) fue 0.19g en P. vulgaris potenciado con M. echinospora y S. griseus sembrado en suelo impactado por el ARA; cuyo valor numérico no tuvo diferencia estadística con los 0.23g de PSA de P. vulgaris alimentado con la solución mineral, sin potenciar mediante M. echinospora y S. griseus sembrado en suelo sin contaminar por el ARA, empleado como CR. Mientras que se registró 0.10g de peso seco radical (PSR) en P. vulgaris potenciado con M. echinospora y S. griseus, sembrado en el suelo impactado por el ARA; este valor numérico fue estadísticamente diferente a los 0.06g de PSR de P. vulgaris sin potenciar con M. echinospora y S. griseus sembrado en suelo no impactado por el ARA o CR.

En la tabla 4 se muestra en suelo la concentración de ARA después de la FITO por P. vulgaris potenciado mediante M. echinospora y S. griseus; en donde se detectó la mayor eliminación del ARA, desde 29,600 ppm hasta 1,492 ppm; valor inferior a la máximo permitido por la NOM-138, este valor numérico de concentración final del ARA, fue estadísticamente diferente al registrado en el suelo usado como CN; ahí la mezcla de hidrocarburos, se redujo desde 85,000 ppm hasta 59,500 ppm derivado de la acción de la atenuación natural.

La BIS del suelo mediante un detergente que eficazmente disolvió la mayor parte de los alifáticos del ARA (Tabla 2) (Mohamed y Mahfoodh, 2006; Burghal et al., 2015), seguida de la BIS con la solución mineral que aportó las sales esenciales de NH4⁺ y NO3^- para ajustar desequilibrio C:N causada por el exceso de ARA; mientras que los PO₄ ⁺³ (fosfatos) solubles aceleraron la eliminación del ARA, apoyado por la BIS mediante el H₂O₂ que suplió el O₂ indispensable en la continua oxidación de esos hidrocarburos (Riojas-González et al., 2010), en tanto que la BIS mediante el extracto fúngico crudo que contenía la lacasa se sugiere fue útil en degradación algunos de los aromáticos del ARA (Baltierra-Trejo et al., 2016); y que posteriormente se mineralizaron en productos inocuos: CO₂ y H₂O. Para lograr las acciones integrales de la BIS, fue indispensable el ajuste de la humedad del suelo al 80% de la capacidad de campo del 80%, lo cual facilitó la circulación del agua y gases a través de los poros del suelo, con la consecuente mejor mineralización del ARA, cuyo proceso es estrictamente aeróbico. Lo que explica porque en un tiempo relativamente corto de 150 días la concentración, se redujo desde 85,000 ppm hasta 29,000 ppm como resultado de la BIS secuencial, complementaria y acumulativa por las acciones de BIS que se señalaron previamente (Pinto et al., 2007; Burghal, et al., 2015).

En la tabla 3 se presenta la FITO del suelo contaminado por 29,000 ppm de ARA, que se demostró por los valores de las variables respuesta en la fenología y biomasa de P. vulgaris que fue potenciado mediante la actividad benéfica de M. echinospora y S. griseus: lo que sugiere que ambos géneros de actinomicetos transformaron los exudados de la semilla y de las raíces en sustancias promotoras de crecimiento vegetal, que mejoraron la capacidad de tolerar algunos de los efectos fitotóxicos de los hidrocarburos del ARA (Hernández-Valencia y Mager, 2003; Solans & Vobis, 2003). Además de que la literatura apoya que tanto M. echinospora como S. griseus podrían degradar ciertos aromáticos del ARA lo que contribuyó a decrecer la concentración del ARA a un valor inferior al máximo aceptado por la NOM-138 (Pérez-Armendariz et al., 2011), en contraste P. vulgaris sin potenciar con estos géneros de actinomicetos, o solo con un tipo como fue el caso de M. echinospora o S. griseus sugieren dos principales razones: una que el metabolismo de cada uno de los géneros de actinomicetos, se complementan para evitar que los hidrocarburos del ARA sean fitotóxicos para P. vulgaris, por lo que cuando ambos no estaban en la planta (B), la raíz fue incapaz de eliminarlos a un nivel inferior al máximo valor aceptado por la NOM-138, y la segunda que por causa de la hidrofobicidad del ARA, se impidió la absorción de agua y el intercambio de gases en el sistema radical, en consecuencia hubo una inhibición del crecimiento de las raíces de P. vulgaris (Cubillos et al., 2014; Juárez-Cisneros y Sánchez-Yáñez, 2014).

la BIS de suelo impactado por 85,000 ppm de ARA, mediante un detergente que emulsificó la mayor parte de la mezcla de hidrocarburos (Tabla 4), con una solución mineral que promovió su oxidación, apoyado por el H₂O₂ como un fuente mediata de O₂ y el extracto fúngico crudo que contenía la casa decreció parte la fracción aromática del ARA, y el control de la humedad del suelo generaron las condiciones ambientales para que la microbiota autóctona heterotrófica aerobia haya decrecido el ARA hasta 29,000 ppm; lo que facilitó la FITO mediante P. vulgaris con M. echinospora y S. griseus que aceleraron la mineralización del ARA hasta una concentración de 1,492 ppm puesto que al hacer el análisis de lo que desapareció en la mezcla de hidrocarburos tanto la fracción alifática como aromática había decrecido a un valor inferior al mayor aceptado por la NOM-138 para considerar que el suelo fue biorremediado (Pinto et al., 2007; Cubillos et al., 2014).

Los resultados de esta investigación mostraron que la BIS de un suelo impactado por una relativa elevada concentración de ARA de 85,000 ppm; fue reducida mediante un combinación de acciones secuenciales, complementarias y acumulativas que lo redujeron hasta 29,000 ppm, complementada por la FITO mediante P. vulgaris, una leguminosa que mejoró su capacidad fitodegradadora del ARA, al ser potenciada por M. echinospora y S. griseus, al disminuir el valor de la mezcla de hidrocarburos hasta 1,492 ppm, un valor inferior al máximo permisible por la NOM-138. Con base en lo anterior la BIS y FITO fue una opción ecológica para remediar un suelo impactado por una relativa alta concentración de ARA.