Presencia de integrones clase I y II para resistencia antimicrobiana en serotipos de Salmonella de importancia pecuaria en el Noroeste de México

Las bacterias del género Salmonella están constituidas por más de 2,500 serovariedades (Pati et al., 2013), siendo los serotipos Salmonella Choleraesuis, Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium patógenos que infectan a varias especies de animales destinados a la producción pecuaria, lo cual ocasiona pérdidas económicas y causan problema para la salud pública (Arcos-Ávila y Mora-Cardona, 2011). La salmonelosis constituye una de las más comunes y ampliamente distribuidas enfermedades trasmitidas por los alimentos, constituyéndose en un problema de salud pública y produciendo elevados gastos en los sistemas de seguridad social (Mejia et al., 2008).Una variedad de alimentos han sido implicados como vehículos de transmisión de la salmonelosis a los humanos, incluidos los de aves de corral, carne de res, carne de cerdo, huevos, leche, queso, pescado, mariscos, frutas, jugo y verduras (Khan et al., 2009). En México, cada año se reportan alrededor de 110 000 casos de salmonelosis asociados al consumo de agua y alimentos contaminados (DGE, 2006). Los medicamentos más auto recetados son ciprofloxacina, aminoglucósidos y tetraciclinas para el tratamiento de infecciones. Diversos reportes han mostrado un incremento en la emergencia de Salmonella y E. coli con niveles significativos de resistencia a los antimicrobianos. En adición a la automedicación terapéutica, en veterinaria y en agricultura se aplican antimicrobianos de manera indiscriminada (López-Cuevas et al., 2009). El objetivo de este trabajo fue identificar la presencia de integrones clase I y II para determinar la resistencia antimicrobiana en varios serotipos del género Salmonella, aisladas de alimentos y animales de importancia pecuaria en el noroeste de México.

Para este estudio se obtuvieron 185 cepas del género Salmonella a partir de casos clínicos de cerdos, aves y alimentos. Los aislamientos se corroboraron con pruebas bioquímicas de rutina. Posteriormente se realizó la serotipificación de los aislamientos acuerdo al esquema de Kauffman y White utilizando antisueros dirigidos para el antígeno somático “O” y flagelar “H” para el género Salmonella. Se realizó un perfil de la resistencia antimicrobiana en todos los aislamientos por medio del método de difusión en gel (Kirvy Bauer) para bacterias gramnegativas. Después se realizó la extracción de ADN utilizando un juego comercial (InstaGeneTM Matrix) y el DNA fue cuantificado para realizar los PCR (NanoDrop® ND-1000). Todos los aislamientos fueron analizados por PCR en tiempo real (Fuentes-Arriaga et al., 2013). Para la identificación de la integrasa clase I se utilizaron los oligonucleótidos (IntAf GGCATCCAAGCAGCAAGC e IntAr AAGCAGACTTGACCTGAT) y para la clase II (IntBf ATCGCAATAGTTGGCGAGT IntBr GCAAGGCGGAAACCCGCGCC) (Lynne et al., 2008).

En este estudio se encontró una resistencia, para CB de 41 %, para AM de 39.46 % y CL de 36 %, Córdova en 2008 encontró un perfil de resistencia para AM de un 35.5% y para CB de un 96.8%, Inocencio en 2011 obtuvo un perfil de resistencia para AM de un 29% y para CB un 39%, Douadi et al. en 2010 para AM un 29.7%; también se obtuvo un valor alto de resistencia a un anfenicol que es el cloranfenicol (CL). Otros autores también obtuvieron valores altos de resistencia para este antimicrobiano, Inocencio en 2011 obtuvo un 27%, Douadi et al., 2010 obtuvieron un 21.2%, Rayamajhi et al., 2008 encontraron un 56.8%, que como se observa también sigue siendo uno de los antimicrobianos más utilizado desde hace muchos años para el control de la salmonelosis en la producción porcina mundial a pesar de ser prohibido por producir aplasia medular en niños (Mejia et al., 2008), a pesar de la creación de un anfenicol de nueva generación (florfenicol). Este nuevo antimicrobiano conserva todas las cualidades farmacológicas y farmacocinéticas de su antecesor y por otro lado se elimina el efecto sobre la medula ósea. Por otro lado, se observa que algunas opciones serian la utilización de otros antimicrobianos como es el caso de ceftriaxona (CTX), que es una cefalosporina de tercera generación, donde en este estudio se obtuvo un 0% de cepas resistentes, en otros estudios se obtuvieron valores muy bajos de resistencia, Córdova en 2008 obtuvo 1.61%, Inocencio en 2011 encontró un 4%, y Mejia et al., 2008, reportaron un 1 %.

De las 185 cepas de Salmonella, 69 (37.29%) presentaron el integrón clase I, y solamente 2 cepas (1.1%) expresaron el gen de la integrasa clase II. En otros estudios, Córdova en 2008 encontró la presencia del integrón I en 22 (38.59 %) y el integrón clase II en 22 (38.59 %), Peirano et al en 2006 en Brasil obtuvieron la presencia del integrón clase I en 55 (40.74 %) cepas y del integrón II en 1 (0.74 %) cepa de un total de 135 cepas de Salmonella. Por lo tanto la presencia de los integrones varió entre un estudio y otro ya que cada clase de integrón codifica resistencia a distintos antibióticos y como en los estudios no hubo el mismo origen de las cepas los antibióticos empleados no fueron los mismos y como el integrón clase I tiene la capacidad de incorporar más de 60 genes de resistencia principalmente a aminoglucosidos como la gentamicina, amikacina, Penicilinas, cloranfenicol, tetraciclina, eritromicina, cefalosporinas, trimetoprim/sulfonamidas, por tal motivo la presencia de este integron se encontró con mayor frecuencia esto corrobora con otros autores, (Coque-González, 2005), (Cambray et al. 2010).

Los integrones son elementos genéticos que transportan genes de resistencia, ocasionando que las cepas generen multiresistencia, principalmente el integron clase I, el cual se encuentra aproximadamente entre 22% y 59% de los aislados de bacterias Gram-negativas (Cambray 2010). Inocencio en 2011 encontro la presencia del integrón clase I en el 65 % de las cepas de Salmonella enterica aisladas de alimentos en Michoacán, Majtánová et al en 2010 encontraron el integrón clase I en 40.41 % de las cepas de Salmonella typhimurium aisladas de humanos en Slovakia, Rayamajhi et al 2008 encontraron el integrón clase I en 68.6 % de cepas de Salmonella typhimurium aisladas de cerdos en Korea, Lee et al 2009 encontraron el integrón clase I en 81.7% de cepas de Salmonella choleraesuis aisladas de humanos y animales en Taiwán, y Peirano et al. (2006), demostraron la presencia del integrón clase I en 40.74 % y del integrón II en 0.74 % de cepas de Salmonella entérica aisladas de humanos, animales y alimentos en Brasil.

Los integrones son considerados elementos genéticos que pueden integrar genes de resistencia en bacterias, y así estas generen multiresistencia. Se han encontrado relaciones entre multiresistencia y presencia de integrones clase I de un 71 % en Michoacán (Inocencio, 2011), un 66.66% en el Estado de México (Cordova 2008), un 20.33% (Lin-Thong y Modarressi, 2011). Estos valores altos nos indican que sí hay relación entre la multiresistencia y la presencia de los integrones más que nada en los de clase I ya que estos son los que más se relacionan con la inserción de genes para resistencia a antibióticos (Cambray 2010).

El integrón clase I confiere resistencia principalmente a: aminoglucósidos como la gentamicina, amikacina, penicilinas como la ampicilina y la carbenicilina, cefalosporinas, trimetoprim/sulfonamidas, tetraciclina, eritromicina, cloranfenicol. Mientras que el integrón clase 2 se presentó solamente en 2 cepas resistentes a cloranfenicol. El integrón clase II tiene la capacidad de portar genes con resistencia a antibióticos como son cloranfenicol, kanamicina, estreptomicina, sulfadiacina, trimetoprim, mercurio, amonio cuaternario, tetraciclina y estreptomicina (Córdova, 2008). Al observar los perfiles de resistencia por antimicrobiano y a los antibióticos a los que codifican principalmente los integrones clase I y II, nos damos cuenta de que la resistencia si correlaciona con la presencia de los integrones.

Los aislamientos de Salmonella fueron identificados bioquímica y molecularmente, encontrando un fragmento 378 pb el cual corresponde al gen de invasividad invA, el cual es característico de esta bacteria.

Las pruebas de serotipificación con antisueros somáticos (O) y flagelares (H), revelaron que el serotipo más frecuente en este tipo de aislamientos fue Salmonella choleraesuis con un 47 %.

Mediante el método Kirby-Bauer se observó que de las 185 cepas de Salmonella se presentó mayor resistencia para los antimicrobianos ampicilina, carbenicilina y cloranfenicol; 39.46%, 41% y 36% respectivamente. En cambio, para amikacina, ceftriaxona y netilmicina hubo un 100 % de sensibilidad.

El integrón clase I fue el más frecuente al encontrarse en 69 (37.29%), de los aislamientos mientras que el integrón clase II solamente en 2 (1.1%) aislamientos.

Se presentó multirresistencia antimicrobiana en 56 de 185 aislamientos, de las cuales 34 (62.96 %) presentaron el integrón clase I y ninguna presentó el integrón clase II. El integrón clase II solo se presentó en 2 cepas resistentes a 1 antibiótico.

El 100% de los aislamientos resistentes a pefloxacilina (13/185) presentaron el integrón clase I, mientras que para carbenicilina para la cual hubo mayor cantidad de aislamientos resistentes (76/185), 41(53.94%) lo presentaron.